Assassin’s Creed 2 knüpft fast nahtlos an die Geschehnisse des ersten Teils an und versetzt den Spieler in die Rolle von Desmond Miles, der Nachfahre des Assassinen Altair ist und bereits im ersten Teil mittels einer Maschinen in die Erinnerung seines Urahnen geschickt wurde. Der Versuch wurde damals von einer geheimen Organisation namens Abstergo, die unter anderem in Verbindung mit den Templern steht, durchgeführt.
