Der Portal 2-Singleplayer enthält neue dynamische Charaktere, eine Vielzahl brandneuer Puzzle-Elemente und ein deutlich größeres Arsenal tückischer Testkammern. Die Spieler werden in bislang unerforschte Bereiche der Aperture Science Labs vordringen und dabei auch wieder auf GLaDOS treffen, die manchmal brandgefährliche Computergefährtin, die sie bereits durch das erste Spiel geführt hat.
Der Zwei-Spieler-Koopmodus umfasst eine separate Kampagne mit eigenständiger Story, eigenen Testkammern und zwei neuen Spielercharakteren. In diesem neuen Modus müssen die Spieler alles, was sie über Portale zu wissen glaubten, in Frage stellen. Für den Erfolg müssen sie nicht nur kooperativ handeln, sondern auch kooperativ denken.